长链DNA连接酶

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DNA copy主要的特点是半保留copy、半不连续copy。在copy过程中,原来双螺旋的两条链并没有被破坏,它们分成单独的链,每一条旧链作为模板再合成一条新链,这样在新合成的两个DNA分子中,一条链是旧的而另外一条链是新的,因此这种copy方式被称为半保留copy。

DNA的两条链是反向平行的,一条是 5'→3'方向,另一条是 3'→5'方向。在copy起点处,两条链解开形成copy泡(replication bubble ), DNA向两侧copy形成两个copy叉(replication fork)。随着DNA的不断解旋,两条链变成单链形式,可以作为模板合成新的互补链。但是,生物细胞内所有的DNA聚合酶都只 能催化 5'→3'延伸。因此,以3 '→5'的链为模板链时,DNA聚合酶可以沿 5'→3'的方向合成互补的新链,这条链称为前导链(leg strand )。当以另一条链为模板时则不能连续合成新链,这条链称为滞后链(lagging strand )。这时,DNA聚合酶从copy叉的位置开始向远离copy叉的方向合成1?2 kb的新链片段,待copy叉向前移动相应的距离后,又重复这一过程,合成另一个类似大小的新链片段,这些片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment)。后,由另一种DNA聚合酶和DNA连接酶负责把这些冈崎片段之间的RNA引物除去,并把缺口补平,使冈崎片段连成完整的DNA链。这种前导链的连续copy和滞后链的不连续copy在生物细胞中是普遍存在的,称为DNA的半不连续copy。




制备互补DNA,往往需要先分离从目的基因转录来的mRNA.如果该基因编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质,则此基因的产物是总mRNA的主要组成部分 。就胰岛B细胞而论,此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA,后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖核蛋白体,如果用特异结合所表达的蛋白质(抗原),长链DNA连接酶,则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA,一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。在这种情况下,不得不以密度梯度离心,按分子量大小把总mRNA分开,然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔网织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用沉淀或聚酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白,从而确定表达该蛋白的特异mRNA。








DNA copy的引发

所有DNA的 copy都是从固定起始点开始的,而目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链,而不能从头合成DNA链,那么一个新DNA的 copy是怎样开始的呢?研究发现,DNA copy时,往往先由引发酶在DNA模板上合成一段RNA引物,再由DNA聚合酶从RNA引物 3'端开始合成新的DNA链。对于前导链来说,这一引发过程比较简单,只要有一段RNA引物,DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链来说,引发过程就十分复杂,需要多种蛋白质和酶的协同作用,还牵涉冈崎片段的形成和连接。






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