菲牛蛭养殖及水蛭素提取专利

1、菲牛蛭养殖生态学\生化成分及抗凝活性研究

　　菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)隶属无吻蛭目，是一种珍贵的医用水蛭。主要对我国华南地区菲牛蛭养殖生态学、生化成分及其抗凝血酶活性进行了研究。在菲牛蛭繁育过程中，密度、季节、温度、体重、年龄和应激刺激等因素能对菲牛蛭亲本的性腺发育和繁殖效率产生重要影响。研究了上述6个因子对亲蛭繁殖的影响。在季节和密度实验中，分为秋冬和春夏2个季节，分别设置4个(5、20、30和50尾/箱(0.05m3土层))和7个密度梯度(5、10、15、20、25、30和50尾/箱(0.05m3土层))；结果表明在不同季节下，产茧率、产茧数、孵化率和孵化数等繁殖指标有明显差异，其中，春夏季节孵化时间短于秋冬季节，而产茧数和孵化数高于秋冬季节；当繁殖密度为5-10尾/箱时，亲蛭的繁殖效率最高，当繁殖密度为50尾/箱时，亲蛭的繁殖效率最低，而且亲蛭死亡率高，具有明显抑制作用。在交配.....................共65页

2、人工养殖菲牛蛭抗凝血活性物质含量动态变化

　　主要研究了在人工养殖条件下，不同时期的菲牛蛭体内抗凝血物质含量的动态变化情况，同时优化了菲牛蛭活体、干体、唾液腺分泌物中的抗凝血活性物质的提取方法和检测方法。1.由于菲牛蛭抗凝血活性物质提取方法的多样性，我们选择了一些具有代表性的方法(蒸馏水直接提取、有机溶剂去除杂质蛋白、盐析等方法)进行提取以体外抗凝血活性为指标，通过定性(凝血酶直接滴定法)和定量(ChromonymTH为生色底物的比色法)的方法检测后，选定了最适合提取抗凝血活性物质的方法。同时优化了提取工艺和检测方法。2.人工养殖条件下，由于菲牛蛭取食机会比较多，所以菲牛蛭的生长动态曲线，类似于连续生长动态曲线。在不同的养殖时期，随着菲牛蛭年龄的增加，每条菲牛蛭体内的抗凝血物质含量逐渐增加，但增长速度比菲牛蛭体重增加速度要低，因此单位质量菲.....................共140页

3、人工养殖菲牛蛭菌性疾病研究 

　　本文对菲牛蛭在工厂化养殖条件下发生疾病的病原菌的形态、生理生化特性、对多种药物的敏感性、防治方法以及病蛭组织的显微病理变化进行了研究。从患病的菲牛蛭腐烂处深层肌肉分离病原菌，得到6株优势菌，编号为0601、0602、0603、0604、0605、0606。通过对以上六株菌的菌落和菌体形态观察、初步生理生化特征分析，菌株0601、0603、0605的形态特征一致，菌株0602、0604.、0606的形态特征一致，取菌株0601、0602作为实验用菌。经人工感染试验，0601号菌液浓度为108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml时的肌注感染死亡率分别为100﹪、100﹪、60﹪.....................共77页

4、广西菲牛蛭中菲牛蛭素的分离纯化与体内外抗凝血实验 

　　本研究旨在从广西菲牛蛭中分离纯化菲牛蛭素(Bufrudin)，并对其物理、生化性质及体内外抗凝作用进行研究，用30﹪硫酸铵分步沉淀、离子交换、凝胶过滤和高效液相色谱法分离纯化广西菲牛蛭消化液中的菲牛蛭素，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白分子量，等电聚焦法测定等电点，并测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)以及对凝血因子的影响，结果表明，广西菲牛蛭中的抗凝物质BDA、BDB均有很强的抗凝活性.....................共65页

5、中药水蛭的提取工艺\质量控制及药理研究 

　　对传统活血化瘀中药水蛭的抗凝血活性部位进行了提取、分离和纯化。建立了水蛭提取液蛋白含量测定及抗凝活性测定的质控方法。以水蛭提取液中蛋白质含量及活化部分凝血活酶时间(APTT)为指标分别考察药材在不同溶媒、温度、提取时间、溶媒倍量及提取次数条件下的提取效果。在此基础上对水蛭提取物的抗结石、抗纤维化的药理作用进行了初步研究。初步建立了在60℃条件下，采用10倍于药材重量的4﹪NaCl水溶液分3次提取药材6h(3h+2h+1h)，作为干品宽体金线蛭的提取工艺。采用10倍于药材重量的4﹪NaCl水溶液，在30℃条件下分3次提取药材6h(3h+2h+1h)，作为活体蛭的最佳提取工艺。考察了水蛭提取物对抗酸损伤(0.1M HCL)致.....................共54页

6、天然水蛭素分离纯化的研究

　　水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中所含的一种蛋白质，是迄今世界上已发现的最强的凝血酶特效抑制剂，是一类很有前途的抗凝化瘀药物。世界各地科学家都在研究水蛭素，有很多关于水蛭素的报道和专利，但以前人们关于水蛭素提取的报道大多数都要杀死整条水蛭来获得水蛭素，本实验以南宁科康生物有限公司养殖的菲牛蛭的提取物为原料，将其分离纯化条件进行优化，以获得活性更高的水蛭素产物。首先是比较了硫酸铵分级沉淀盐析法、有机溶剂沉淀法和pH沉淀法三种蛋白质沉淀法对水蛭素分离纯化的效果，确定了利用硫酸铵分级沉淀盐析对水蛭唾液分泌物进行粗分离纯化，通过多次离心分段盐析和两次离心分段盐析效果表明：35％～55％饱和度的(NH4)2SO4(Wa)是较理想的盐析范围，确.....................共57页.

7、活体诱导高效提取水蛭素工艺的研究 

　　本项研究对比三种传统提取水蛭素的方法，采用仿生法刺激活体水蛭使其分泌出唾液，瞬间收集水蛭唾液，然后应用超滤对唾液进行高效快速膜分离纯化，再经离子交换和凝胶过滤层析中间纯化，最后应用高效液相进一步纯化得到高纯度的水蛭素，达到多次高效提取水蛭素的目的。其中传统提取水蛭素的方法采用硫酸铵沉淀法、PH值沉淀法、有机沉淀法；活体诱导采用猪血+田螺联合诱导的方式诱导出水蛭唾液，然后再收集水蛭唾液。粗级分离比较了PH值沉淀法、硫酸铵沉淀法、有机沉淀法及超滤膜分离法。DEAE-纤维素离子交换层析用0.05mol/L，pH6.0磷酸盐缓冲液平衡，0-1.0mol/LNacl梯度洗脱，流速30mL/h，进样量为100ml。所得到的水蛭素溶液蛋.....................共65页

8、菲牛蛭室内高密度养殖技术

　　从运输、孵化、生长特性、幼蛭培育和成蛭养殖等方面较系统地研究了菲牛蛭的人工养殖技术。摸索出了菲牛蛭的安全长途运输方式，采用泡沫箱加冰干运法，26-30℃条件下长途运输29小时，存活率达99％。统计了菲牛蛭卵茧的大小、湿重，平均大小为2.05cm×1.28cm，平均湿重1.66g，采用卵茧上覆盖湿布保湿，室温孵化，孵化率82.8％，刚产出的稚蛭平均重量0.06g。进行了幼蛭培育试验，养殖密度1227尾/m2,25-31℃温度下，经30天培育，平均体重由0.06g增至1.9g，成活率为74％。研究了菲牛蛭的摄食量、代谢和生长曲线，平均摄食量是体重的3.6倍，摄食系数与体重相关性不明显，吸血后的快速代谢期，小于1g的菲牛蛭约为3天，大于1g的约为6天，生产中幼蛭培育期投喂间隔可.....................共55页

9、水蛭素的分离纯化与聚乙二醇修饰

　　水蛭素是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂，本文对天然水蛭素的提取纯化以及聚乙二醇修饰展开研究，并对修饰产物的性质进行初步探索。目前人们对于天然水蛭素的提取进行了大量的研究，本文在水蛭素纯化过程中，对水蛭预处理、粗提和纯化步骤进行了研究。在水蛭预处理中比较了微波、缓冲液提取、烘干、冻干四种方法，证实微波法可导致水蛭素失活，后三种方法对于水蛭素活力保留没有差别。在粗提过程中，采用pH选择法可以很好地使水蛭素活力保留，粗提液比活力为3.19 ATU/mg。使用离子交换以及凝胶过滤层析法纯化粗提液，经离子交换层析后得到产物比活为9.1×103ATU/mg。经SDS-PAGE电泳分析证实得到水蛭素纯度较高。作为最强的凝血酶抑制剂，水蛭素存在体内半衰期短等的药用缺点。聚乙二醇修饰是目前有效地延长其半衰期的方法。本文用琥珀酰亚胺活化的mPEG 5 kDa和mPEG .....................共48页


10、一种新型双功能水蛭素与其制备方法和应用
11、高效表达重组水蛭素与其生产方法
12、一种水蛭提取物与其生产方法和用途
13、菲牛蛭养殖方法与水蛭素提取技术
14、宽体金线蛭人工繁育方法
15、一种水蛭素冻干粉针制剂与其制备方法
16、水蛭提取物美容护肤液与其制备方法
17、水蛭养殖塘防逃装置
18、水蛭养殖防逃水池
19、菲牛蛭人工养殖方法
20、一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素方法与应用
21、烫水蛭配方颗粒制备方法
22、水蛭素制取方法
23、一种水蛭真空冷冻干燥工艺
24、水蛭养殖箱
25、一种以菲牛蛭唾液为原材料水蛭素生产工艺
26、一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料水蛭素生产工艺
27、一种水蛭真空冷冻干燥方法
28、一种水蛭保健药酒与其生产方法
29、一种天然水蛭素有效成分提取方法
30、一种天然水蛭素有效成分提取方法
31、一种水蛭提取物与其制备方法与应用
32、一种水蛭提取物与其制备方法与应用
33、水蛭防逃逸装置
34、水蛭防逃逸装置
35、水蛭孵化育苗方法
36、一种医用吸血水蛭产品制备与新用途
37、一种水蛭素双水相-反胶束提取法
38、水蛭素生理盐水-聚乙二醇双水相提取法
39、吸血水蛭高密度绿色生态养殖方法
40、水蛭素重组体制备方法
41、医用天然水蛭素提取方法
42、高分子量脱硫水蛭素
43、水蛭素与亲脂化合物水蛭素结合物
44、用亲合色谱法提纯水蛭素方法
45、无腥味水蛭粉炮制工艺
46、水蛭素

水蛭养殖、菲牛蛭养殖提取文献资料

47、池塘水蛭养殖技术研究
48、仿生诱导高效提取水蛭素及分离纯化的研究
49、菲牛蛭的人工养殖方式试验
50、菲牛蛭的人工越冬试验
51、菲牛蛭细菌性疾病的病原检验及药物防治
52、广东菲牛蛭生长和生殖的研究
53、宽体金线蛭提取工艺研究
54、浅谈水蛭的人工养殖
55、水蛭常规饲养技术
56、水蛭池塘养殖技术
57、水蛭的捕捉和人工饲养
58、水蛭的采收与加工
59、水蛭的采收与加工技术
60、水蛭的炮制研究浅述
61、水蛭的生物学特性和养殖技术
62、水蛭的生物学特性及养殖技术
63、水蛭的养殖技术
64、水蛭化学成分的分离及分析
65、水蛭化学成分的分离及分析概述
66、水蛭及其养殖基地农药与重金属残留分析
67、水蛭冷冻干燥过程优化及最佳工艺条件的确立
68、水蛭酶提取工艺的研究
69、水蛭人工养殖及加工技术
70、水蛭生物特性与养殖技术
71、水蛭实用养殖技术
72、水蛭乙醇提取工艺的研究
73、水蛭中水蛭素含量测定的改进
74、提取水蛭有效成分初探
75、我国菲牛蛭的研究概况
76、药用金线水蛭的人工养殖
77、3种常用药物对菲牛蛭的急性毒性试验