革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒

本试剂盒先用溶菌酶处理，再用碱裂解法裂解细胞， 通过吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附 DNA，可最大限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物。从50-100ml培养液中，可快速提取200-300μg纯净地高拷贝质粒 DNA，提取率达85-90％。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规的分子生物学试验，包括酶切、PCR、测序、连接和 转化等试验。本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入），混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、取50-200ml 细菌培养物，11000rpm离心5min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml 溶液Ⅰ和1ml 溶菌酶，混匀。37℃水浴30 min 以上（根据菌液量可适当加长水浴时间，请先检查溶液Ⅰ是否已加入 RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3、向离心管中加入 5ml 溶液Ⅱ，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10 min ，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5、将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，11000rpm 离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完，可分两次吸附) 。

6、向吸附柱中加入8ml 漂洗液( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入6ml 漂洗液，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、11000rpm离心5min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR 等。

9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 1-2ml 经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心2min，收集质粒DNA溶液。

10、（可选）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，11000rpm离心2min。

1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA 全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。

2、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇)。

3、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

4、洗脱缓冲液体积不应少于500ul，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH 值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其 pH值在8.0左右( 可用NaOH 将水的pH值调至此范围) ，pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20 ℃，以防DNA降解。

5、如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用400-800ml过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

6、DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰， OD260 值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9 ，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

*Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.

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