革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒

本试剂盒先用溶菌酶处理，再用碱裂解法裂解细胞，通过吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物。从1-5ml培养液中，可快速提取5-15μg纯净地高拷贝质粒DNA，提取率达85-90％。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规的分子生物学试验，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入） ，混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、取 1-5ml  细菌培养物，12000rpm离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 200ul  溶液Ⅰ(请先检查是否已加入 RNaseA）, 使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。再向其中加入 50ul  溶菌酶，混匀。37℃水浴 30 min  以上（根据菌液量可适当加长水浴时间）。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。如不能确定为何种菌，请按阳性菌处理。 

3、向离心管中加入 250ul  溶液Ⅱ，温和地上下翻转 6-8  次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以免污染基因组 DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏。 

4、向离心管中加入 350ul  溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。 11000rpm离心 10 min  。注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 

5、将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置 2min，12000rpm  离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(  如果一次加不完，可分两次吸附)  。 

6、向吸附柱中加入 700ul  漂洗液(  使用前请先检查是否已加入无水乙醇)  ，12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 

7、向吸附柱中加入 500ul  漂洗液，12000rpm离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 

8、12000rpm 离心 2min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR  等。 

9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50-200ul  经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心 1min，收集质粒DNA溶液。 

10、（可选）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min， 12000rpm离心 1min。  

1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。

2、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇)。

3、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即盖紧盖子，如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心。

5、如果是提取革兰氏阳性菌质粒，必须在裂解细胞前破细胞壁，方法如下：收集适量菌体，加入250ul溶液Ⅰ充分悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度为10-20mg/ml，37℃处理30min左右。 加入溶菌酶的浓度和处理时间可根据不同的菌株和具体试验条件进行调整。

6、洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul，体积过小会影响回收效 率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液 应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

*Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.

我们所提供的产品仅供科研使用，不得用于临床诊断、治疗、食品或者化妆品等用途！