基因组DNA提取实验公司

1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；

2、细胞转染:取两个EP管，一个加入Opti-MEM、核心质粒和包装质粒；另一个加入Opti-MEM、lipo2000，腺病毒包装实验公司，然后将两管混匀；

3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；

4、收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入病毒上清液，检测阳性细胞比例。

? 全转录组测序? ??

全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncoding RNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一RNA分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能够通过miRNA应答元件（microRNA Respe Element， MRE）竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。举个例子：miRNA会导致基因沉默现象发生，而如果lncRNA竞争性结合了miRNA，从而影响了miRNA基因沉默功能实现。

? ? ? ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容，靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析，从而发现新的调控网络模型。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了small RNA的信息，所以需要另外再构建一个small RNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示：

分子实验介绍——荧光定量PCR检测

荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。

结果示例：

图 A 基因扩增曲线图；B 基因扩增溶解曲线图；C mRNA相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。

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