X-α-Gal（α-半乳糖苷酶显色底物/酵母双杂交检测）

—  — 酵母双杂交检测系统/蛋白-蛋白相互作用分析

搜索关键词：X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；α-半乳糖苷酶 a-galactosidase；MEL1基因；GAL4酵母双杂交系统；CAS：107021-38-5；蓝白斑筛选；

基本描述：

X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一种用来检测α-半乳糖苷酶（也称为蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的显色底物。X-α-Gal的使用，避开双杂交分析中β-半乳糖苷酶溶液制备和滤膜提升实验（filter-lift assay）的繁琐操作，只需直接添加在培养基上，通过蓝色沉淀的生成与否，即可用来检测双杂交相互作用。X-α-Gal可用来区分肠杆菌科内的不同物种以及划分乳酸菌和双歧杆菌。组织学研究中，X-α-Gal还可借助光学显微镜来检测组织的α-半乳糖苷酶活性。

利用α-半乳糖苷酶水解二糖-蜜二糖作为碳源，酵母菌得以正常生长或进行发酵。酿酒酵母菌内，该酶由几种GAL基因调控的MEL1基因所编码。一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培养基上的X-α-Gal，使得菌落产生蓝斑。酵母双杂交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。

X-α-Gal优势：

避开双杂交分析中β-半乳糖苷酶溶液制备和滤膜提升实验（filter-lift assay）的繁琐操作，只需直接添加在培养基上，通过蓝色沉淀的生成与否，即可用来检测双杂交相互作用。

X-α-Gal与酵母双杂交系统：

酵母双杂交筛选是体内用来检测蛋白-蛋白相互作用的一种遗传分析实验，此方法由Prof. Stan Fields及合作者开发用来调查两个已知蛋白的相互作用，另一个重要应用是从文库内筛选并鉴定某一特定蛋白的未知结合蛋白。阳性克隆也就是那些能够激活报告基因转录子，使得营养缺陷型酵母双杂交菌株在营养缺陷选择性培养基上生长的菌落。大多数双杂交方法使用大肠杆菌的LacZ基因作为第二个报告基因，通常要使用非常耗时的filter-lift assay来鉴定能在第二种选择性平板上生长的菌落。而替换使用的X-α-Gal，可直接在营养缺陷性的选择培养基上来检测基于GAL4-转录子的双杂交作用。

基本特性：

1）   CAS NO：107021-38-5

2）   化学名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；

3）   分子式：C₁₄H₁₅BrClNO₆

4）分子量：408.64g/mol

5）纯度：≥98%（TLC）

6）外观：白色或近白色结晶粉末

7）化学结构：

使用方法【懋康整理】

方法1：直接倒入固体培养基

1）   溶解60mg X-α-gal于3ml DMF得20mg/ml储存液，马上使用或者避光储存于-20℃，6个月稳定；

2）   将高压灭菌好的琼脂培养基于室温冷却至50℃；

3）   按照每升培养基加入1ml 20mg/ml X-α-gal储存液的用量，直接加入冷却好的琼脂培养基；【若有需要，此时也可加入筛选用的抗生素】；

4）   倒平板，使用前必须让培养基室温凝固（通常至少需30min）。

方法2：涂布于预制培养平板上

1）   溶解24mg X-α-gal于6ml DMF得4mg/ml储存液，马上使用或者避光储存于-20℃，6个月稳定；

2）   超净工作台内放置已经倒好的固体培养基，使其表面干燥；

3）   吸取200μl (15cm平板) 或100μl（10cm平板）4mg/ml X-α-gal 储存液于预制培养平板上，并涂布使其均匀分散在表面【注意：平板边缘通常很难得以充分涂布，可能导致假阳性克隆生成。建议条件可能下，于平板中央挑取克隆】。

4）   使用前将上述涂布好的筛选平板于超净工作台内，至少晾干30min；

5）   将转化好的细菌或酵母涂于平板上，分别置于37℃或30℃倒置培养，直至蓝色菌落出现。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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