Cas9制备基因敲除细胞系

EGE系统介绍

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9已经被广泛应用于细胞系和动物基因敲除。但将这些技术应用于基因敲进时，外源DNA同源重组效率一直很低。为了提高同源重组效率，百奥赛图公司在ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术的基础上，开发和优化出一套高效的基因敲除／基因敲进系统（Biocytogen Extreme Genome Editing System，简称EGE系统）。EGE系统比普通的CRISPR/Cas9技术介导的同源重组效率提高了10~20倍，从而使得基因改造更加快速和方便。利用EGE系统，几乎可以在基因组中的任意位点，对DNA序列进行各种精确地编辑，实现细胞系的基因敲除、基因敲进、及多位点同时敲进。从而方便在细胞系对目的基因进行研究，或是研究目标蛋白间的相互作用。与传统的RNAi介导的knockdown相比，得到的基因改造细胞系表型更稳定，结果更可靠。百奥赛图公司已经开始将EGE系统用于细胞基因编辑服务。

EGE系统应用案例

利用EGE系统，百奥赛图公司制备了在ACTB（细胞骨架丝状蛋白）基因编码框翻译起始位点敲进EGFP（融合蛋白）的U2OS细胞系，以及在LMNB1（核蛋白）基因编码框起始位点敲进EGFP（融合蛋白）的大鼠C6细胞系。

1、打靶载体设计

i:ACTB基因编码β-actin蛋白，它是一种细胞骨架蛋白。打靶载体同源臂约为1Kb，分别利用Crispr/Cas9和EGE系统介导打靶载体的同源重组ii:LMNB1基因编码核蛋白Lamin-B1。打靶载体同源臂约为1Kb，分别利用Crispr/Cas9和EGE系统介导同源重组

①:利用流式细胞术分析重组效率发现，在U2OS细胞系中，CRISPR/Cas9介导的EGFP-ACTB基因敲进效率只有1.91%，而EGE系统可以达到15.02%，提高了约8倍;

②:在C6细胞系，EGE系统将EGFP-LMNB1的敲进效率从0.19%升至3.6%，提高了约19倍。