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显微镜
立体显微镜的选择标准
时至今日,立体显微镜仍基于提到的技术方法——格里诺或 CMO 原理。
四个事项需要仔细评估:
a)用途是什么?
b)哪种结构需要观察、记录或可视化?
c)有多少人在使用显微镜?
d)解决方案的可用预算是多少?
一旦上述因素已知,则可以归结为以下标准。放大倍数、变焦范围和物场景深和数值孔径光学质量和工作距离
人体工学
照明
放大倍数、变焦范围和物场
立体显微镜的总放大倍数,是变倍器、物镜和目镜的放大倍数的组合。
变倍器或变焦体像放大镜一样,变倍器由光学透镜构成,可以用来改变仪器的放大倍数。改变变倍器的位置,会改变图像放大的程度。图像放大的程度称为放大倍数。现代立体显微镜能够提供 16 倍放大(只有变焦体),20.5:1 的变焦范围,其特点是能够进行可靠测量的机动化或编码。
接下来,图像通过目镜得到进一步放大。为找出目镜中观察到的目标的放大程度,用户必须将变倍器和目镜的放大倍数相乘。
然而为了保证完整性,提供公式如下:
MTOT VIS 为我们要计算的放大倍数。 VIS 代表“视觉”。
z 是变倍器的等级。
ME 为目镜的放大倍数。
MO 为主物镜的放大倍数(当格里诺系统中未使用辅助透镜时为 1 倍)
物场当从适当的距离向目镜中观察、而且瞳孔间距设置正确时,可以看到称为物场的一个圆形区域。 物场的直径根据放大倍数而变化。换言之,放大倍数和物场直径之间存在着数学关系。 10 倍目镜提供的物场数是23。这意味着变焦体和主物镜放大 1 倍时,物场大小为23mm。 3 倍放大时物场减少到三分之一,即物场的直径仅有7.66mm。
景深和数值孔径
在显微镜中,景深往往被视为一种经验参数。 实际上它是由数值孔径、分辨率和放大倍数之间的相关性确定的。为了得到良好视觉印象,现代显微镜的调整设施会在景深和分辨率——在理论上具有负相关性的两个参数——之间产生一种上线平衡。
视觉景深的实际价值
在视感景深这个问题上,Max Berek 发表观点的作者,早在 1927 年他就发表了经过大量实验得来的结果。Berek 公式给出了视觉景深的实际值,因此今天仍然使用。
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显微镜
当代生命科学研究对光学显微技术提出了越来越高的要求——更高的空间分辨率、更大的成像深度、更快的成像速度。特别是对于生物活体显微成像来说,生物组织对光的散射使得噪声大大增强,严重影响了空间分辨率和成像深度。为了提高成像深度,双光子激发激光扫描荧光显微技术自20世纪90年代提出后被广泛应用于神经成像等领域,显微镜买卖,但是其逐点扫描的成像方式严重制约了成像速度。因为高分辨率光学显微镜的景深很小,显微镜回收,要对样品完成三维成像,通常需要数十层乃至上百层的二维图像进行叠加重建得到,图像采集和处理一般需要数分钟甚至数十分钟,要快速实时地获取和显示三维图像非常困难。
瞬态室超分辨成像团队在研究员姚保利和叶彤的带领下,以双目视觉原理和贝塞尔光束产生扩展焦场为基础,显微镜,提出了由四个振镜组成的激光束立体扫描装置,原子力显微镜,实现了对贝塞尔光束的横向位置和倾角共三个维度的控制,突破了只有两个自由度的传统激光扫描不能实时切换视角的限制。通过对四振镜立体扫描装置的优化设计和控制,实现了对贝塞尔光束的三自由度快速扫描,可在毫秒量级进行双视角切换,从而解决了激光扫描立体显微成像系统中双光路同时成像的技术难题,一次实现了基于双视角实时激光扫描的立体显微成像和显示系统。该系统可对样品进行立体动态成像和实时双目立体观测,其三维成像速度比传统的逐点扫描方式提高了一到两个数量级。该双光子立体显微系统为活体生物的三维实时成像和显示提供了一种新的观测工具。
“它可以让我们像观看立体电影一样实时地观测动态的三维微观世界,无需光切片,无需耗时的三维图像重构。”杨延龙如此总结这套系统的特点,他负责设计和完成了其中的立体扫描和成像显示的关键部分。“双目视觉成像是非常有效的三维信息获取方式,但是现有的体视显微镜,空间分辨率和景深互相制约,我们利用三自由度扫描的贝塞尔光束进行非线性荧光激发突破了这种限制。”
这项研究先后在中科院“百人计划”和国家自然科学的支持下,从基本原理验证、关键技术突破,到原理样机完成,经历了从基础研究到应用集成的各个环节。目前,课题组正在与国内外相关科研机构开展生物医学应用的合作研究,期望尽快将该项技术应用于生物活体三维快速成像和显示领域。
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